Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos de Helianthus tuberosus L. e Smallanthus sonchifolius em cama de frangos

Carolina Toshie Kamimura1

Nair Massumi Itaya2

Terezinha Knöbl3

Gessé Gomes4

Antônio Carlos Pedroso5

Márcia Cristina Menão6

Resumo
A avicultura brasileira tem um papel importante no cenário internacional por produzir proteína animal de altíssima qualidade a um custo acessível. O aumento da produção nas últimas décadas tem influenciado positivamente nos aspectos sociais e econômicos do agronegócio. Entretanto, os aspectos ambientais têm se tornado motivo de preocupação na cadeia produtiva principalmente com a alta produção anual de toneladas de cama de frango com potencial de disseminação de micro-organismos a outras aves e seres humanos, além de impactos ambientais. Desta forma é necessário haver algum tipo de tratamento da mesma para minimizar possíveis contaminações de agentes patogênicos. Algumas plantas têm potencial para serem utilizadas para este fim como o Helianthus tuberosus L. e Smallanthus sonchifolius que sintetizam substâncias com comprovadas propriedades antimicrobianas e de fácil preparação de seus extratos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação de extratos brutos dessas plantas em amostras de cama de frangos comerciais quanto à redução do número de bactérias aeróbias e anaeróbias. Realizou-se o tratamento de três amostras de cama de frango com extratos de ambas as plantas com 50 mg de massa seca/grama de cama. Através de análises microbiológicas comparou-se o número de bactérias anaeróbias e aeróbias nas amostras tratadas e nos controles após três e 24 horas. Os resultados demonstraram redução na carga bacteriana aeróbia e anaeróbia nas camas testadas. Novas concentrações de extratos e outros períodos de ação devem ser testados para avaliar a possível potencialização da ação das substâncias.
Palavras-chave: ação bactericida; cama de frango; Helianthus tuberosus L.; Smallanthus sonchifolius.

Evaluation of the antimicrobial activity of the crude extracts of Helianthus tuberosus L. and Smallanthus sonchifolius in poultry litter

Abstract
Brazilian poultry has an important role in the international scenario, producing high quality animal protein at an affordable cost. The production increase in recent decades has positively influenced agribusiness in its social and economic aspects. However, environmental issues have become a concern in the production chain, mainly due to the annual production of tons of poultry litter, which can potentially disseminate microorganisms to other birds and humans, amongst other environmental impacts. In this context, poultry litter must undergo processing in order to minimize possible environmental contamination by pathogens. Some plant extract products with proven antimicrobial properties, such as Helianthus tuberosus L. and Smallanthus sonchifolius can be potentially used for this purpose. The objective of this work was to evaluate if the crude plant extracts of these plants could reduce the number of aerobic and anaerobic bacteria in commercial poultry litter samples. Three poultry litter samples were treated with the crude extracts from both plants in the proportion of 50mg of dry mass per gram of poultry litter. The number of aerobic and anaerobic bacteria in experimental and control samples were compared using microbiological analysis after three and 24 hour treatments. The results demonstrated a reduction in the aerobic and anaerobic bacterial load in the experimental poultry litter samples. Different crude extract concentrations and treatment times should be tested to evaluate the potentiation action of such extracts.
Key words: bactericidal action; chicken bed; Helianthus tuberosus L.; Smallanthus sonchifolius.

1. Introdução

   A avicultura brasileira representa atualmente 1,5% do PIB, gerando 3,5 milhões de empregos diretos e indiretos. A produção de frangos está presente em todas as regiões do país, com destaque para as regiões sul e sudeste. Cerca de 90% das aves abatidas são produzidas no sistema de integração vertical, onde a empresa detém o controle de todos os elos da cadeia, ou seja, produção, abate, processamento e distribuição. Isso gera renda e a fixação do homem do campo em sua terra, viabilizando a pequena propriedade (Apba 2017).

   Segundo François (2013) todo o desenvolvimento alcançado ocorreu graças às novas técnicas, ao melhoramento genético das linhagens de aves, ao desenvolvimento de rações balanceadas e de melhor qualidade e à legislação direcionada à sanidade, entretanto várias doenças continuam a ocorrer.

   Em uma produção avícola intensiva a cama tem como função evitar o contato direto da ave com o piso, auxiliar a absorção de água, a incorporação de fezes, urina e penas, agir como um isolante térmico e evitar calos e lesões nas patas e no peito das aves, sendo constituída normalmente de maravalha de pinus (raspas de madeira) (Daí Prá Roll 2012).

   Com o aumento da produção de aves de corte ocorreu proporcionalmente o aumento da quantidade da cama gerada (Santos et al. 2000). Por muito tempo, o uso desta como alimento para bovinos foi uma forma de dar um destino útil, sem contaminar o meio ambiente. Entretanto em 2001, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento, através da Instrução Normativa n° 15 de 17 de julho (Brasil 2001) proibiu a sua utilização para a alimentação de ruminantes. Dessa forma houve a necessidade de buscar alternativas para minimizar os impactos ambientais para o seu descarte e também reduzir contaminações para seu uso em outros lotes de aves.

   A compostagem é um dos métodos utilizados como tratamento da cama, porém para o processo se completar e ser considerado seguro, há a necessidade de 28 a 42 dias, o que torna o tratamento inviável para ser realizado durante o vazio sanitário das aves, cujo período é muito inferior a este prazo (Kelleher et al. 2002).

   Pesquisas indicam que algumas substâncias extraídas de plantas possuem potencial antimicrobiano, sem produzir riscos no seu uso no meio ambiente (Duarte 2006). H. tuberosus (Jerusalém artichoke) e S. sonchifolius (Yacon) sintetizam lactonases quiterpênicas, compostos com diversas atividades biológicas como, por exemplo, bactericida (Alvarenga et al. 2016). Estas substâncias extraídas podem ser promissoras para o tratamento das camas e consequentemente diminuírem a contaminação em criações comerciais, com menor risco de transmissão de doenças e contaminação ambiental.

2. Objetivo

   Avaliar a ação de extrato bruto de H. tuberosus e S.sonchifolius sobre bactérias aeróbias e anaeróbias em camas de frangos de criações comerciais.

3. Materiais e métodos

   H. tuberosus e S.Sonchifolius foram cultivados a partir de propagação vegetativa de rizóforos e tubérculos, respectivamente, na Chácara dos Ipês, no município de Guararema (SP) (Latitude: 23° 24’ 45’’ Sul e Longitude: 46° 2’ 28’’ Oeste) de setembro de 2016 a abril de 2017.

4. Preparação dos extratos hidroalcoólicos

   Os extratos hidroalcoólicos foram preparados segundo metodologia descrita por Pinho et al. (2012) com modificações, no laboratório de Microbiologia do Complexo Educacional FMU.

   Aos sete meses de cultivo, as folhas de ambas as espécies (H. tuberosus e S. sonchifolius) foram colhidas e expostas ao sol em recipiente fechado por tela, durante três dias para secagem. Em seguida foram trituradas em multiprocessador doméstico, adicionado etanol 50%, na proporção de 1:3 (p/v), e incubadas em banho maria por 30 minutos. A suspensão foi filtrada através de tecido de voil quádruplo.

   Os extratos foram concentrados até a secura em estufa a 60ºC (5 dias) e ressuspendidos com água destilada na concentração de 200 mg de massa seca/mL (Figura 1).

   

   

   Figura 1. Preparo de extratos desidratados de H. tuberosus e S.sonchifolius

5. Cepas bacterianas

   Para verificar a atividade antimicrobiana dos extratos extraídos de H. tuberosus e S. sonchifolius foram utilizadas duas bactérias sendo uma Gram negativa (Escherichia coli -ATCC 25922) e uma Gram positiva (Staphylococcus aureus - ATCC 29213). Essas cepas foram cultivadas em placas de Petri contendo ágar soja tripticaseína (TSA) e incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas.

6. Avaliação de inibição de crescimento em meio líquido

   Os extratos utilizados de H. tuberosus e S. sonchifolius foram esterilizados em autoclave à 121°C por 15 minutos.

   Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizou-se o teste de microdiluição em triplicata com o caldo Brain Heart Infusion (BHI) (DIFCO®).

   Foram utilizadas microplacas de 96 cavidades, fundo V, onde 100 µL dos extratos de H. tuberosus e S. sonchifolius foram adicionados nas seguintes concentrações: 6,25; 12,5; 25; 50; 100 e 200 mg de massa seca/mL (Figura 2).

   Para a preparação dos inóculos bacterianos as cepas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram cultivadas em caldo BHI e incubadas a 37ºC por 24 horas. A turbidez foi ajustada com solução salina estéril (0,9%) pela escala de MacFarland com padrão de 0,5 e confirmada em espectrofotômetro a 600 nm. Foram diluídas na ordem de 1:1000 em caldo BHI de modo a obter uma concentração final de aproximadamente 5 X 105 UFC/mL.

   Foram utilizados controles negativos (somente o meio BHI) e positivos (cepas bacterianas acrescidas de BHI).

   

   Figura 2. Esquema do ensaio utilizado para determinação de concentração inibitória mínima (MIC).

   Os resultados da concentração inibitória mínima (MIC) de H. tuberosus e S. sonchifolius em relação à Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram avaliados pela turvação do meio.

7. Avaliação da atividade de H. tuberosus e S. sonchifolius em cama de frango

   Três amostras de camas de frango de diferentes granjas do Estado do Paraná com várias reutilizações de lotes de aves foram coletadas no mês de maio de 2017 (Quadro 1).

   Quadro 1. Camas testadas e número de lotes de frangos nelas utilizados

   Cama	Número de lotes de aves
   1	15
   2	2
   3	8

   Amostras de 25 g de cada cama foram pulverizadas com 6,25 mL das soluções dos dois extratos a 200 mg de massa seca/mL (H. tuberosus e S. sonchifolius) a fim de alcançar a concentração de 50 mg de massa por grama e acondicionadas em temperatura ambiente. Foi selecionada uma amostra de cada cama como controle negativo (sem adição dos extratos).

   Todas as amostras foram avaliadas por contagem de aeróbios e anaeróbios totais em zero hora (antes das pulverizações), três e 24 horas após a pulverização.

   As amostras (25g) foram diluídas em 225 mL de caldo BHI e tituladas até 10-10 sendo semeadas em triplicatas para contagem de aeróbios e anaeróbios em placas de Petri contendo TSA e incubadas a 37ºC, sendo as placas para crescimento de anaeróbios foram colocadas em jarra de anaerobiose.

8. RESULTADOS E DISCUSSÃO

   O aumento da produção de carne de frango nas últimas décadas gerou a preocupação com o descarte de passivos ambientais como a cama de frango, que apresenta potencial de contaminação ambiental e de transmissão de doenças para animais e seres humanos (Abpa 2017, Daí Prá Roll 2012).

   A reutilização desta por vários lotes não é recomendada, mas é uma realidade no Brasil, devido a razões como o impacto ambiental, o custo de aquisição do novo material, a mão-de-obra para o correto manejo do substrato da cama, o custo para a retirada do substrato do galpão e também o tempo de vazio sanitário após sua retirada (Fiagá 2014, Silva et al. 2007, Paganini 2004).

   Algumas técnicas e substâncias têm sido testadas para a inativação de micro-organismos contidos nas camas durante o vazio sanitário realizado entre os lotes de aves como a compostagem e o bissulfato de sódio, que apresentam limitações em seus usos (Oliveira et al. 2004, Carvalho Neto et al. 2007).

   A vida média da ave desde a entrada do lote no aviário até a sua saída é de aproximadamente 42 dias. Os animais ficam sobre a cama onde eliminam excretas, modificando a composição e acrescentando micro-organismos novos a ela. A cada ciclo de nova utilização existe uma carga biológica maior o que poderá favorecer a perpetuação de patógenos entre os lotes, desta forma existe a recomendação de não reutilizar em caso de ocorrência de problemas sanitários (Silva et al. 2007).

   O calor também é utilizado para minimizar a quantidade de micro-organismos da cama. A compostagem é um método que utiliza o calor produzido espontaneamente pelo metabolismo dos micro-organismos que estão na cama. Na compostagem completa ocorre a degradação dos resíduos na presença de oxigênio, isto é, ocorre uma degradação aeróbia do resíduo orgânico por um processo que necessita de 28 a 42 dias e ao final do período, a matéria orgânica estará estabilizada (Kelleher et al. 2002).

   Na avicultura convencional esse método foi adaptado, pois o tempo de compostagem da cama foi reduzido para o período entre 4 a 17 dias, sendo realizada durante o período de vazio sanitário, Desta forma a matéria orgânica não fica estabilizada, mas promove a redução da quantidade de micro-organismos nos aviários (Macklin et al. 2006).

   Outro ponto a ser considerado são os promotores de crescimento, utilizados desde a década de 1950 nas criações de aves, que são na maioria compostos por antibióticos e quimioterápicos. O uso indiscriminado desses medicamentos em doses não terapêuticas incorporadas nas dietas tem sido considerado como um dos maiores problemas no manejo destes animais, pois pode induzir resistência a inúmeros micro-organismos, inclusive patogênicos que permanecerão nas camas de frangos podendo ser transferidos a animais e seres humanos (Silva 2000).

   A carga microbiana inicial de todas as camas pesquisadas foi elevada, tanto para bactérias aeróbias como anaeróbias (Quadro 2), o que pode representar risco , pois estas são reutilizadas para outros lotes de aves que são colocados sobre este material com somente um dia de idade (Fiorentin 2005).

   O H. tuberosuse e o S. sonchifolius possuem uma variedade de bioprodutos que têm ação sobre alguns micro-organismos (Milani et al. 2009, Moura al. 2012). A opção pelo extrato bruto das plantas foi baseada na ação sinérgica existente entre os compostos e não 2002). A utilização das folhas também é um método sustentável que permite a sobrevivência das plantas.

   Ambos os extratos apresentaram inativação de Staphylococcus aureus (bactéria Gram positiva) a partir de 50 mg/mL no teste de concentração inibitória mínima (MIC), entretanto não houve inibição de crescimento de Escherichia coli (bactéria Gram negativa). Essa ação pode ter ocorrido devido à estrutura da parede celular das bactérias, pois as Gram positivas possuem parede mais rígida, com menor teor de lipídeos e são quimicamente menos complexas que as Gram negativas (Trabulsi e Alterthum 2015).

   Em aerobiose a utilização de extratos de H. tuberosus e S. sonchifolius produziu uma melhor qualidade microbiológica das camas, pois diminuiu o número de bactérias nas três camas testadas na maioria dos períodos quando comparados aos controles. Em aerobiose as camas tratadas com H. tuberosus produziram diminuição em uma casa logarítmica na cama 1 e 2 e de duas casas na cama 3 após três e 24 horas de tratamento, quando comparadas aos controles. Também houve diminuição do número de bactérias nas camas tratadas com S. sonchifolius, sendo de uma casa logarítmica nas camas 1 e 2 e de duas casas logarítmicas na cama 3, quando comparadas aos controles (Quadro 2). Deve-se considerar que algumas bactérias anaeróbias podem permanecer na forma de esporos nas camas e não tendo ocorrido ação dos extratos nesta forma de apresentação das bactérias.

   Quadro 2. Resultados de titulação de bactérias aeróbias e anaeróbias em camas de frango tratadas com extrato de Helianthus tuberosus L.., S. sonchifolius e controles

   		Aerobiose			Anaerobiose
   		Zero hora UFC	3 horas UFC	24 horas UFC	Zero hora UFC	3 horas UFC	24 horas UFC
   Cama 1	Controle	3,6 x 10-7	2,0 x 10-6	3,6 X 10-6	3,6 x 10-7	4,4 x 10-6	3,6 x 10-7
   	Ht	3,6 x 10-7	2,8 x 10-6	1 X 10-5	3,6 x 10-7	2,7 x 10-6	2,4 x 10-6
   	Ss	3,6 x 10-7	2,1 x 10-6	1 x 10-5	3,6 x 10-7	1,6 x 10-6	3,6 x 10-6
   Cama 2	Controle	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7	1 X 10-6	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7
   	Ht	3,6 x 10-7	3,6 x 10-6	3,6 X 10-6	3,6 x 10-7	1,1 x 10-6	1,1 x 10-6
   	Ss	3,6 x 10-7	3,6 x 10-6	3 x 10-5	3,6 x 10-7	1,6 x 10-5	4 x 10-6
   Cama 3	Controle	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7	3,6 X 10-7	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7
   	Ht	3,6 x 10-7	3,6 x 10-7	2,4 X 10-4	3,6 x 10-7	1,1 x 10-5	2 x 10-5
   	Ss	3,6 x 10-7	2,2 x 10-6	1 x 10-4	3,6 x 10-7	4,0 x 10-5	6 x 10-4

   Ht - Helianthus tuberosus

   Ss - S. sonchifolius

   UFC – Unidade Formadora de Colônia

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS

   Os extratos de H. tuberosus e S. sonchifolius apresentaram ação antibacteriana sobre bactérias aeróbias e anaeróbias em algumas das camas de frangos de criações comerciais testadas em alguns períodos quando comparadas aos controles. Novos testes devem ser realizados com outras concentrações dos extratos e diferentes períodos de exposição para avaliar uma possível potencialização da ação antibacteriana sobre bactérias aeróbias e anaeróbias.

10. AGRADECIMENTO

Ao Prof.Dr. Flávio Aparecido Baldisseri Jr. pela contribuição na revisão do abstract.

REFERÊNCIAS

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Trabulsi LR, Alterthum F. Microbiologia. 6ª ed. Rio de Janeiro: Editora Atheneu; 2015. 920p.

Recebido em: 30/10/2017
Aceito em: 15/05/2018

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